NatGen人类乳腺癌单细胞空间图

撰文：骄阳似我

IF：38.33

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亮点：

1.本文开发了一种内在亚型分类（SCSubtype）的单细胞方法来揭示复发性肿瘤细胞异质性。通过测序对细胞转录组和表位进行索引和进行免疫分型（CITE-seq）可提供高分辨率的免疫图谱，包括与临床结果相关的新PD-L1/PD-L2+巨噬细胞群。

2.本文对人类乳腺癌进行了单细胞和空间分辨转录组学分析，将其分为九类，称为“生态型”，具有独特的细胞组成和临床结果。本研究提供了乳腺癌细胞结构的综合转录图谱。

乳腺癌是一种多样的细胞微环境，因此异型相互作用在确定疾病病因和治疗反应方面非常重要。虽然乳腺癌通常被认为具有较低的突变负担和免疫原性，但有证据表明免疫激活在一部分患者中起着关键作用。例如，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的存在是新辅助化疗的良好临床结果和完全病理反应的生物标志物。相反，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）通常与不良预后相关，被认为是癌症免疫治疗的重要新兴靶点。根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）的表达和人表皮生长因子受体2（HER2）的过度表达或HER2基因ERBB2的扩增，乳腺癌在临床上进行分层。根据PAM50基因特征的大量转录组分析，乳腺癌也被分为五个“固有”分子亚型：腔型（LumA和LumB）、HER2富集型（HER2E）、基底型和正常型。分子亚型和临床亚型之间约有70-80%的一致性。虽然PAM50为预后和治疗提供了重要见解，但目前对这些亚型在细胞分辨率上的功能理解有限。

间充质细胞也已成为恶性表型、化疗反应和抗肿瘤免疫的重要调节因子。然而，由于缺乏明确的细胞分类学，进展受到阻碍。最近对癌症相关成纤维细胞（CAF）的研究确定了由细胞外基质（ECM）产生或炎性分泌体定义的两种极化状态。在乳腺肿瘤中，这些不同的细胞亚群彼此之间、与肿瘤微环境（TME）中的其他细胞以及与疾病状态和进展之间的关系仍有待阐明。

近期，在Naturegenentics杂志上发表了一篇名为“Asingle-cellandspatiallyresolvedatlasofhumanbreastcancers”的文章，文章开发了一种内在亚型分类（SCSubtype）的单细胞方法来揭示复发性肿瘤细胞异质性。通过测序对细胞转录组和表位进行索引和进行免疫分型（CITE-seq）可提供高分辨率的免疫图谱。对人类乳腺癌进行了单细胞和空间分辨转录组学分析，将其分为九类，称为“生态型”，具有独特的细胞组成和临床结果。

为了阐明乳腺癌的细胞结构，本文通过scRNA-seq分析了26例原发肿瘤，包括11例ER+、5例HER2+和10例TNBC。总共有个单细胞通过了质量控制，并使用典型谱系标记进行了注释。所有主要的细胞类型在所有肿瘤和临床亚型中均有表达。由于乳腺癌在很大程度上是由DNA拷贝数变化驱动的，本文使用inferCNV31估计单细胞拷贝数变异（CNV）谱，以区分肿瘤细胞和正常上皮细胞。结果显示了患者独特的拷贝数变化和乳腺癌中常见的拷贝数变化。图1

原发性乳腺癌的细胞组成和恶性上皮细胞的鉴定。

因为无监督聚类不能用于发现肿瘤间复发的肿瘤细胞基因表达特征，本文探究是否可以使用已建立的PAM50方法对细胞进行分类。由于单细胞数据固有的稀疏性，本研究开发了一种与scRNA-seq兼容的内在分子亚型分析方法。对于数据集中的每个PAM50子类型，本文执行肿瘤细胞的成对整合和差异基因表达，以确定4组定义单细胞衍生分子亚型的基因（89个基因，基础SC；个基因，HER2ESC；46个基因，LumA_SC；65个基因，LumB_SC）并将这些基因定义为“SCSubtype”基因特征。本文还使用TCGA对大量RNA-seq数据进行聚类，确认其中14个样本使用其伪批量图谱进行聚类。这些结果突出表明，当应用于批量和scRNA序列数据集时，本文的三种亚型方法之间具有很强的一致性。SCS亚型和GM分析为肿瘤性ITTH的分类提供了补充性的新方法，并进一步证明肿瘤细胞在大多数肿瘤中表现出不同的表型。图2

确定肿瘤性乳腺癌细胞异质性的驱动因素。

在基质室中确定了三种主要细胞类型，包括CAF、血管周围样（PVL）细胞、内皮细胞以及两个较小的淋巴内皮细胞簇（LYVE1）和循环PVL细胞。利用Monocle进行分析，发现了五种CAF状态。状态1（称为s1）具有间充质干细胞（MSCs）和炎症样CAF（ICAF）的特征，具有干细胞标记物（ALDH1A1、KLF4和LEPR）的高表达以及与化学吸引和补体级联相关的通路（CXCL12和C3）。随着细胞向分化状态s4和s5转化，这些标记物的表达降低。对于PVL细胞确定了三种状态。PVLs1和s2表达与干细胞、未成熟周细胞和粘附分子相关的标记物。它们进一步丰富了与受体结合和血小板衍生生长因子活性相关的途径。本文确定了三种内皮状态，内皮细胞s1类似于柄状和静脉内皮细胞（ACKR1，SELE和SELP），富含与细胞粘附（ICAM1和VCAM1）和抗原提呈/主要组织相容性复合体（MHC）（HLA-DRA）相关的途径和基因。随着细胞分为两种状态，这些标记物随着假时间的推移而减少，这两种状态都伴随着DLL4的表达升高。内皮s2由RGS5和ESM1区分，而s3表达细胞迁移和血管生成的调节因子（CXCL12和VEGFC）。在临床亚型和三个正常乳腺组织样本中发现了类似的CAF、PVL和内皮细胞状态，表明它们可能是TME中经历重塑的常驻细胞类型。图3

乳腺癌不同间充质分化状态的转录谱和表型分析。

为了深入了解细胞类型的空间组织，对六个样本进行了空间分辨转录组学研究，包括来自scRNA序列队列的两个ER+（CID和CID）和两个TNBC（CID和CID），以及在独立实验室处理的另外两个TNBC（F和F）。结果表明这些GMs不是基于分离的方法学的产物。为了系统地理解模块之间的空间关系，计算了所有癌症部位GM得分之间的Pearson相关性。这揭示了在所有六个病例中大部分保守的两个主要簇，包括一个簇中的GM1、GM3、GM5和GM6，另一个簇中的GM2和GM4。有趣的是，GM3（EMT、IFN、MHC）和GM4（增殖）在所有样本中都表现出强烈的负相关，这表明不同的癌症表型发生在乳腺癌相互排斥的区域。图4

使用空间分辨转录组学绘制乳腺癌异质性图。

虽然一些研究表明间充质细胞在调节抗肿瘤免疫方面发挥重要作用，但组织中基质细胞和免疫细胞之间的相互作用尚待研究。本文在六个病例中的五个病例中发现了肌成纤维细胞样CAF和ICAF之间的中度负Pearson相关性。类似的CAF定位在7例HER2+乳腺肿瘤的独立空间转录组数据集中是一致的，表明这种关系在临床亚型中是保守的。为了探索这些区域中CAF-淋巴细胞相互作用的潜在介体，研究了CAF和CD4+/CD8+T细胞最富集位置的顶级配体-受体相互作用，并通过scRNA-seq检测这些相应细胞类型。这揭示了免疫调节iCAF配体和同源T细胞受体的富集，包括趋化因子、补体途径、转化生长因子-β和淋巴细胞抑制/激活分子。通过整合信号预测和细胞邻近性，这些数据突出了CAF直接调节免疫细胞的相关候选。在大多数情况下，LAM1和LAM2细胞之间表现出适度的负空间相关性，这可能表明普通LAM单元通过其局部TME向LAM1或LAM2极化。在所有三种亚型的八种肿瘤中，LAM2细胞而不是LAM1细胞与CD4+和CD8+T细胞呈正相关，表明这些小生境在调节抗肿瘤免疫方面可能具有功能相关性。图5

空间映射新的异型细胞相互作用。

本文的单细胞数据生成了乳腺肿瘤细胞分类，在26个肿瘤中观察到细胞频率的显著变化和复发模式。一致聚类显示九个肿瘤簇具有相似的估计细胞组成（“生态型”）。至于预后，E2肿瘤患者的预后最好，而E3肿瘤的5年生存率较低，这与基底样和高度增殖肿瘤的已知不良预后一致。E7的预后也很差，主要是HER2E肿瘤和HER2E_SC细胞的富集。E4也有相当大比例的HER2E和基底样肿瘤，但这些患者的预后明显优于E7，这可能是由于肿瘤免疫细胞浸润的结果。在代谢分析和生态型分析中，这些是预后最差的组。然而，大多数生态型没有明确与特定的整合基因组簇或PAM50亚型相关联，基质细胞和免疫细胞在定义生态型中的作用反映了这一点。这种缺乏独特关联的现象表明，生态型并不是分子或基因组亚型的简单替代物。图6

使用单细胞特征对乳腺癌队列进行反褶积，发现与患者生存率和固有亚型相关的强大生态型。

在这项研究中，我们提供了乳腺癌分类的综合细胞模型的重要进展。从三个层面定义了乳腺肿瘤的细胞结构。首先，详细的细胞分类法，包括新的细胞类型和状态以及表征细胞异质性的新方法。第二，肿瘤内细胞位置和相互作用的空间地图，揭示组织内肿瘤和宿主细胞表型的协调，并揭示细胞之间的空间关系。第三，利用去卷积技术，观察到了一组具有相似细胞类型比例和预后相关性的肿瘤，称为生态型，通常由特定的共分离细胞簇驱动。

这项研究有几个局限性。首先是对scRNA-seq使用组织分离和液滴封装，导致某些细胞类型，包括脂肪细胞、肥大细胞和粒细胞的代表性不足。其次是每个临床亚型的病例数量有限，这限制了估计亚型特异性特征的能力。为了以与先前PAM50批量分类器一致的方式对肿瘤细胞进行分类，本文开发了SCSubtype，用于对批量分析失败的低细胞数肿瘤进行分类。虽然在乳腺癌中长期观察到亚型标记物（例如细胞角蛋白，ER）的异质性表达，但不知道这些是否仅仅是标记物表达的异常或反映了功能多样性。SCS亚型为后者提供了证据，表明大多数癌症中存在固有的亚型异质性。

教授介绍：

AlexanderSwarbrick

AlexanderSwarbrick在澳大利亚金霍恩癌症中心（TheKinghornCancerCentre）和GarvanInstituteofMedicalResearch研究院担任项目领头人，AlexanderSwarbrick使用临床前模型来测试这些新疗法的疗效，并与临床合作者一起将其推进早期临床试验。AlexanderSwarbrick的实验室主要研究成人乳腺癌和前列腺癌以及儿童期神经母细胞瘤。使用单细胞基因组学和相关技术来揭示癌症微环境中的基因“连接”，以确定疾病的新机制和治疗策略。

参考文献：

SunnyZ.Wu,GhamdanAl-Eryani,AlexanderSwarbrick，etal.Asingle-cellandspatiallyresolvedatlasofhumanbreastcancers.[J]NatureGenetics

VOL53

September

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